Seither hat sich diese Mikroskopie-Technik auf der ganzen Welt immer wieder bewährt, doch ein Team von Wissenschaftlern der TU Wien und der Meduni Wien zeigte nun, dass man bei der Interpretation der Daten sehr vorsichtig sein muss: Die Super-Resolution-Mikroskopie macht zwar einzelne Moleküle sichtbar, aber es kann leicht passieren, dass man ein Molekül mehrfach abbildet. Eine bloße Mehrfachbelichtung kann dann mit einem Cluster aus mehreren Molekülen verwechselt werden. Das Forschungsteam entwickelte Methoden, zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden. Sie wurden nun in Nature Communications publiziert.
"Die Super-Resolution-Mikroskopie, so wie auch wir sie verwenden, bietet einen eleganten Ausweg", erklärt der Biophysiker Mario Brameshuber, einer der Senior-Autoren der Studie vom Institut für Angewandte Physik der TU Wien. "Man verwendet spezielle Moleküle, die durch Laserstrahlen kurz zum Leuchten gebracht werden. Mit diesen Molekülen markiert man die Strukturen, die man sichtbar machen möchte. Wenn diese Moleküle nacheinander aufleuchten, kann man jedes von ihnen als diffuse Lichtscheibe wahrnehmen – und ziemlich genau in der Mitte dieser Lichtscheibe muss das Molekül sitzen." So kann man aus vielen einzelnen Bildern die Position der einzelnen Moleküle ableiten und sie dann am Computer zu einem hochauflösenden Bild zusammenfügen.
Bei der genauen Untersuchung von T-Zellen, die in unserem Immunsystem eine zentrale Rolle spielen, stieß man allerdings auf ein Problem. "Aus biologischer wie immunologischer Sicht spielt es eine wichtige Rolle, ob bestimmte Rezeptoren wie beispielsweise T Zell Antigenrezeptoren gleichmäßig auf der Zelloberfläche verteilt sind, oder ob sie sich zu Gruppen, zu sogenannten Clustern zusammenfinden", erläutert Johannes Huppa, Biochemiker und Immunologe vom Institut für Hygiene und Angewandte Immunologie der Meduni Wien. "Und wie sich zeigte, ist genau diese Frage mit Super-Resolution-Mikroskopie schwer zu beantworten."
Das Team konnte nämlich zeigen, dass verschiedene Moleküle, die man in der Super-Resolution-Mikroskopie als Markierungs-Farbstoffe verwendet, nicht nur einmal sondern auch häufiger aufleuchten können – in manchen Fällen sogar 20 bis 30 mal. "Und dann zieht man mit herkömmlichen Auswertungsmethoden völlig falsche Schlüsse: Es sieht aus, als würde es dort auf engstem Raum einen Cluster aus 20 bis 30 Molekülen geben", sagt Huppa.
Mit viel Aufwand und speziellen biochemischen Tricks gelang es dem Forschungsteam nun, verschiedene Markierungs-Farbstoffe genau zu charakterisieren: Spezielle Proteine wurden jeweils mit unterschiedlichen Markierungs-Molekülen versehen und auf einem Glasplättchen fixiert. Dann wurde das Verhalten der Moleküle genau analysiert: Leuchten sie mehrfach auf, wenn man sie mit einem Laser bestrahlt, oder gehen sie nach dem ersten Aufleuchten kaputt? Wie lange dauert es typischerweise, bis sie nach dem ersten Aufleuchten ein weiteres Mal aufleuchten können?
"Mit diesen Informationen kann man nun das Verhalten der Moleküle am Computer simulieren und mit Super-Resolution-Bildern aus Experimenten vergleichen", sagt Brameshuber. "Und unsere Simulationen zeigen, dass es bestimmte statistische Zusammenhänge zwischen den Leuchtsignalen gibt, die uns verraten, ob einzelne Moleküle häufig oder viele Moleküle je einmal ein Signal im Experiment geliefert haben." Das Bild, das am Ende entsteht, mag mit bloßem Auge gleich aussehen, aber mit Mathematik kann man zusätzliche wichtige Informationen herausholen, welche die Methode in ihrer Aussagekraft verbessert und robuster macht.
COMPAMED.de; Quelle: Technische Universität Wien
